菇类性角膜炎要做什么检查?

菇类性角膜炎要做什么检查?

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　　诊断比较困难，必须与微生物性角膜溃疡进行鉴别。有农业性眼外伤史，典型的临床表现，是诊断的主要依据。再者，疑为菇类感染时，应作角膜病变处刮片。将取下的坏死组织放于玻片上，滴5%氢氧化钾一滴，覆盖破片，立即镜检，寻找菇类菌丝。有条件时应进行菇类培养。

　　1.刮片检查

　　(1)取材：表面麻醉(出色应用0.5%丙氧苯卡因，因该药较其他表面麻醉剂的抑菌作用轻)后，用圆刃刀片从病灶深部或边缘刮取组织。

　　(2)染色技术：常见的有革兰染色技术、Giemsa染色技术以及KOH湿片技术，有时也会使用特殊的菇类染色方法(Gomori美芬染色)，这些染色法的阳性率分别为55%、66%、33%和85%。其中，革兰染色是为简便的，菇类显示为革兰阳性（深紫色），而其他组织则为阴性（红色）。KOH湿片技术则是通过KOH溶液溶解刮片中的非菇类杂质，从而显现出菌丝。有研究表明，加入亮绿、甲绿或墨水的染色（10%氢氧化钾与墨汁按9∶1的比例混合而成）能够增强对比度，在光学显微镜下，菇类细胞壁上会附着墨水或绿色小颗粒，而胶原纤维与炎性细胞则不会被染色，形成鲜明的对比，便于识别。然而，这种方法的缺陷在于可能出现假阳性或假阴性。近，有人采用caleofluor-white染色（CFW染色），该染色剂能够与菇类细胞壁中的壳聚糖和纤维素紧密结合，在荧光显微镜下，菇类呈现出强烈的深绿色。

　　2.菇类培养 刮片检查简单而快速，但只能确定是菇类，而不能鉴别菇类菌种及进行药敏试验，因此，还必须进行菇类培养。常用的培养方法及培养温度如下。

　　(1)血琼脂(blood agar)，25℃及37℃下培养。

　　(2)sabouraud葡萄糖琼脂，25℃及37℃下培养。

　　(3)马铃薯葡萄糖琼脂，25℃及37℃下培养。

　　多数酵母菌易在血琼脂中生长，丝状菌易在sabouraud琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂生长(注意镰刀菌在37℃时，2～3天即可生长，而其他菇类在37℃时，则需要1周以上时间才能生长)。

　　3.聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction，PCR) 国外已有将临床分离出的菇类进行体外培养，并应用PCR技术进行分型诊断，认为PCR技术对于角膜菇类的快速诊断有良好的应用前景，但需要解决假阳性结果的问题。

　　4.几丁质在菇类鉴别中的应用 Lamps(1995)指出，几丁质是一种存在于菇类和节肢动物体内的多糖结构，而哺乳动物则不具备这种成分。菇类细胞壁中的几丁质成分因菌种的不同而存在差异，这使得其具有较高的特异性。不同荧光标记的凝集素能够与特定的几丁质结合，并发出独特的荧光，从而实现快速的菌种诊断与鉴别。目前，国外普遍认为这一技术是一种快速且特异的菇类诊断方法，而在国内尚未有相关报道。

　　1. 角膜活检 当刮片和培养的结果均为阴性，但临床仍怀疑存在菇类感染时，除了需要进行多次反复检查外，还应考虑进行角膜活检。可通过尖刀片切取病变组织，或采用穿透性角膜移植术获取病灶组织，随后进行石蜡包埋固定，制备病理切片，并进行染色以便显微镜下观察。光学显微镜检查的染色方法包括：PAS染色、HE（苏木精-伊红）染色以及抗酸染色等；而荧光显微镜检查则可采用吖啶橙（acridine orange）染色和CFW染色。组织学观察结果如下：

　　(1)“菌丝苔被”是由大量中性粒细胞浸润、角膜基质层的凝固性坏死及胶原纤维肿胀所构成，很少见到完整的菇类。

　　(2)菌丝苔被病灶周围有大量菌丝，菌丝沿角膜板层平行蔓延，也可垂直穿通角膜小板向前向后生长，并穿过后弹力膜到达前房或后房引起炎症反应。

　　(3)“羽毛状边缘”是圆形细胞及浆细胞浸润，并非是菇类的菌丝。

　　2. 共聚焦显微镜（confocal microscope）共聚焦显微镜是20世纪90年代中期兴起的一种活体非侵入性角膜疾病检测技术，能够从细胞层面深入观察角膜的不同层次结构。该技术已被广泛应用于单纯疱疹病毒角膜炎（HSK）和棘阿米巴角膜炎的诊断。Winchester（1997）使用共聚焦显微镜研究曲霉菌性角膜炎，发现角膜内可清晰观察到直径为6µm、长度在40至60µm之间的菌丝。在时间效率、敏感性和靠谱性方面，共聚焦显微镜显著优于以往的任何诊断手段。